Perfiles de expresión de los genes ERG11, MDR1 y AFR1 en Cryptococcus neoformans var. grubii aislados de pacientes con HIV / Gene expression profiles of ERG11, MDR1 y AFR1 in Cryptococcus neoformans var. grubbi isolated from HIV patients

Introducción. El fluconazol es el antifúngico más utilizado para la prevención y el tratamiento de infecciones causadas por el género Cryptococcus, agente etiológico de la criptococosis. La resistencia al fluconazol en los aislamientos de Cryptoccocus neoformans puede hacer fracasar el tratamiento y generar recaídas de la infección. Objetivo. Evaluar los perfiles de expresión de los genes AFR1, MDR1 y ERG11 en aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii, durante la respuesta in vitro a la inducción con fluconazol. Materiales y métodos. Se estudiaron 14 aislamientos de C. neoformans var. grubii provenientes de pacientes con HIV, de los cuales 6 eran sensibles al fluconaol y 8 presentaban sensibilidad disminuida. Los niveles de expresión de los genes ERG11, AFR1 y MDR1 se determinaron mediante PCR en tiempo real. Resultados. Los aislamientos resistentes al fluconazol mostraron sobreexpresión de los genes AFR1 y MDR1, mientras que la expresión de los fenotipos de resistencia evaluados se mantuvo homogénea en ERG11, en todos los aislamientos de C. neoformans var. grubii. Conclusiones. La sobreexpresión de los genes AFR1 y MDR1 que codifican las bombas de eflujo, contribuye a la resistencia al fluconazol en los aislamientos estudiados. Sin embargo, los patrones de resistencia que se registran en este hongo, sumado a los casos de recaídas en pacientes con HIV, no pueden atribuirse únicamente a los casos de resistencia por exposición al fármaco. Otros mecanismos podrían también estar involucrados en este fenómeno, como la resistencia emergente (resistencia mediante otros genes ERG) y la heterorresistencia, los cuales deben ser estudiados en estos aislamientos.

Introduction: Fluconazole is the most used antifungal drug for prevention and treatment of Cryptococcus spp. infections, the etiological agent of cryptococcosis. Resistance to fluconazole among Cryptococcus neoformans isolates can lead to treatment failure and generate relapses. Objective: To evaluate the expression profles of the AFR1, MDR1 and ERG11 genes in C. neoformans var. grubii clinical isolates during the in vitro response to fluconazole induction. Materials and methods: Fourteen C. neoformans var. grubii isolates recovered from HIV patients were studied, in which 6 showed sensitivities to fluconazole and 8 decreased sensitivity. The expression levels of ERG11, AFR1 and MDR1 genes were determined by real-time PCR from extracted mRNA. Results: AFR1 and MDR1 genes from C. neoformans var. grubii were overexpressed in fluconazole resistant isolates, whereas ERG11 maintains homogeneous expression in all the evaluated resistance phenotypes of C. neoformans var. grubii isolates. Conclusions: The overexpression of AFR1 and MDR1 genes, which codify for efflux pumps, contributes to fluconazole resistance in the studied isolates. However, the resistance patterns in this fungus and the relapse cases in HIV patients cannot be attributed solely to the exposure to the drug. Heteroresistance and the emerging resistance (resistance through other ERG genes), might be other mechanisms involved in this phenomenon, which must be studied in these isolations.

Evaluación hemodinámica no invasiva con cardiografía de impedancia: aplicaciones en falla cardíaca y en hipertensión arterial / Non-invasive hemodynamic evaluation with impedance cardiography: applications in heart failure and hypertension

La cardiografía de impendancia (CGI) representa un método no invasivo para la evaluación del estado hemodinámico latido a latido. Aunque se introdujo por primera vez hace más de 40 años, la CGI ha mostrado un resurgimiento en la última década, a partir de una serie de estudios clínicos que han demostrado su precisión en la estimación del volumen latido, tanto contra el "gold-standard" invasivo (termodilución), como contra los métodos de referencia no invasivos (ecocardiografía). Diversos estudios demuestran la utilidad de esta técnica en el manejo del paciente con falla cardíaca y en el enfoque diagnóstico y terapéutico de la hipertensión arterial, por lo cual constituyen actualmente dos de las aplicaciones clínicas más importantes de la CGI. En falla cardiaca, los cambios en el volumen de líquido del tórax y del gasto cardíaco evaluados por CGI, han demostrado ser predictores de descompensación aguda, incluso semanas antes del inicio de la sintomatología respiratoria; además, permiten identificar el origen cardiogénico o respiratorio de la disnea cuando el examen físico y los demás paraclínicos no son concluyentes. En los pacientes con hipertensión arterial no controlada o resistente, la CGI permite realizar una mejor caracterización del fenotipo hipertensivo y elegir la estrategia farmacológica más específica para intervenir la alteración hemodinámica predominante (resistencia vascular vs. gasto cardiaco elevado). En este artículo se realiza una revisión de los principios biofísicos de la CGI y su utilidad en la evaluación no invasiva del estado hemodinámico, así como una evaluación crítica de la literatura que da soporte a su aplicación clínica en el tratamiento de la falla cardíaca y la hipertensión arterial.

Impedance cardiography (ICG) represents a non-invasive method for hemodynamic assessment in a beat-to-beat basis. Since its introduction more than forty years ago, a renewed interest in the use of this technique during the last decade has been noticed, mainly as a result of a series of clinical studies showing its precision in the estimation of stroke volume either against invasive gold standard (i.e. thermodilution) or against non-invasive reference methods (i.e. echocardiography). On the other hand, ICG has demonstrated to be useful for the management of heart failure patients and for the diagnostic and therapeutic approach to hypertension, which currently constitute two of the major applications of ICG. In heart failure patients, changes in thoracic fluid content and cardiac output tracked by ICG have shown to be predictors of acute decompensation even weeks before respiratory symptoms appear; also allowing identification of a cardiac vs. respiratory origin of dyspnea when physical examination and laboratory tests are not conclusive. In the particular case of patients with uncontrolled or severe hypertension, ICG makes possible a better characterization of hypertensive phenotype leading to a more specific choice of pharmacological agents to treat the primary hemodynamic alteration (i.e elevated peripheral resistance vs. elevated cardiac output). The present review, provides a review of the biophysical principles of ICG and its precision in measuring stroke volume and present a critical assessment of the literature supporting its clinical application in the management of heart failure and arterial hypertension.

Kinetic analysis of gene expression during mycelium to yeast transition and yeast to mycelium germination in Paracoccidioides brasiliensis / Análisis de la cinética de expresión de genes durante la transición de micelio a levadura y la germinación levadura a micelio en Paracoccidioides brasiliensis

Introduction: Paracoccidioidomycosis is an endemic systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, a thermally dimorphic fungus that in tissues and cultures at 37°C grows as a yeast while at lower temperatures (less than 24°C) it becomes a mold; however the genes that rule these processes and their expression are poorly understood. Objective: This research focused on the kinetic expression of certain genes in P. brasiliensis throughout the dimorphic process, one that involves the transition from the mycelium to yeast forms and the germination from the yeast to mycelium form. Materials and methods: A real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was optimized to measure the expression of ten genes connected with diverse cellular functions including cell synthesis and wall structure, oxidative stress response, heat shock response, metabolism, proteins’ processing, solute transport across the cell membrane and signal transduction pathways at different time points during the mycelia to yeast transition, as well as in the yeast to mycelia germination processes. Results: Genes involved in cell synthesis and wall structure, metabolism and signal transduction were differentially expressed and highly up-regulated during the yeast to mycelia germination process; on the other hand, genes involved in heat shock response, cell synthesis and wall structure were highly up-regulated during the mycelia to yeast transition process. The remaining genes were differentially regulated during both processes. Conclusion: In this work the up-regulation of certain genes involved in the morphological changes occurring in P. brasiliensis yeast and mycelia forms were confirmed, indicating that these biological processes play an important role during the host-pathogen interactions, as well as in the fungus adaptation to environmental conditions.

Introducción. La paracoccidioidomicosis es una micosis sistémica causada por el hongo termodimorfo Paracoccidioides brasiliensis. En tejidos y cultivos a 37°C crece como levadura, mientras que a temperaturas menores de 24°C crece como un moho. Sin embargo, se conoce poco sobre los genes que regulan estos procesos. Objetivo. Se evaluó la cinética de expresión de algunos genes en P. brasiliensis mediante el proceso de dimorfismo incluida la transición del micelio a levadura y de la germinación de levadura a micelio. Materiales y métodos. Se optimizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para medir la expresión de diez genes relacionados con diversas funciones celulares que incluyeron: síntesis de pared, respuesta al estrés oxidativo, respuesta al choque térmico, metabolismo, procesamiento de proteínas, trasporte de solutos a través de membranas y transducción de señales, todo ello a diferentes tiempos durante la transición de micelio a levadura, así como de la germinación de levadura a micelio. Resultados. Se encontró que los genes relacionados con síntesis de pared, metabolismo y transducción de señales, se expresaban de manera diferencial y con regulación positiva durante la germinaciónlevadura a micelio, mientras que algunos genes relacionados con respuesta a choque térmico y a síntesis de pared estaban sobreexpresados en la transición de micelio a levadura. Los genes restantes se regularon de manera diferencial en ambos procesos. Conclusiones. En este trabajo se confirma la regulación positiva de algunos genes relacionados con los cambios morfológicos de las fases levadura y micelio en P. brasiliensis, procesos biológicos que juegan un papel de importancia durante la interacción huésped-parásito y durante la adaptación del hongo al ambiente, respectivamente.

Identificación de algunos genes asociados al proceso de germinación de la conidia al micelio en Paracoccidioides brasiliensis / Identification of genes associated with germination of conidia to form mycelia in the fungus Paracoccidioides brasiliensis

Introducción. Paracoccidioides brasiliensis es un hongo dimórfico térmico, que a temperatura ambiente se presenta como un moho productor de conidias, mientras que en el huésped se comporta como una levadura de gemación múltiple. Los mecanismos moleculares que rigen la germinación de conidia a micelio aún se desconocen. Objetivo. Estudiar en P. brasiliensis la cinética del proceso de germinación de conidia a micelio y determinar los genes expresados durante este proceso mediante la construcción y el análisis de una librería EST (Expressed Sequence Tag). Materiales y métodos. Para el estudio de la cinética de germinación, se produjeron y aislaron conidias de P. brasiliensis. Estas fueron incubadas en cultivos líquidos a 18°C por 24, 48, 72 y 96 horas, y se examinaron por microscopía de luz. A partir de conidias cultivadas por 96 horas, se construyó y caracterizó una librería EST, la cual representaría los genes expresados durante el proceso de germinación. Resultados. Durante el proceso de germinación de conidia a micelio, se observó 11,7±1,2%, 30±0,6%, 43±1,3% y 66±2,4% de germinación a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación, respectivamente. Además, se obtuvo una librería del proceso de germinación consistente en 129 secuencias agrupadas en cuatro secuencias contiguas y siete secuencias únicas, para un total de 11 posibles genes. Ocho secuencias (72,7%) no habían sido descritas anteriormente en otras librerías informadas para este hongo y podrían representar genes específicos de la germinación de conidia a micelio. Conclusiones. Éste es el primer reporte en el que se identifican genes no descritos anteriormente, que son expresados durante la germinación de conidia a micelio, proceso de gran importancia en la biología de P. brasiliensis.

Introduction. Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus. At room temperature it grows as a mold that produces conidia, whereas in the vertebrate host it grows as a multiple-budding yeast. The molecular mechanisms involved in the germination from the conidia to the mycelia process remain unknown. Objective. The kinetics of conidia to mycelia germination process were studied in the dimorphic fungus P. brasiliensis. Gene expression during this process was evaluated by construction and analysis of an EST library. Materials and methods. For the germination kinetics study, P. brasiliensis conidia were isolated as single cell units. Then, they were cultured at 18° C in BHI (brain-heart infusion) broth for 24, 48, 72 and 96 hr. After each perion, they were examined by light microscopy. From conidia harvested at 96 hr, an EST library was constructed; at this stage the gene expression was presumed to be maximal for the germination process. Results. During the conidia to the mycelia developmental process, the following germination rates were observed: at 24 hr, 11.7±1.2%; at 48 hr, 30±0.6%; at 72 hr, 43±1.3%; and at 96 hr, 66±2.4%. At the 96 hour stage, an EST library was constructed. It consisted of 129 sequences grouped in 4 contigs and 7 singlets for a total of 11 possible genes. Eight of the sequences had not been described previously in other EST libraries of this fungus. Conclusions. New genes were identified that were expressed during the conidia to the mycelia germination process and may represent genes specific to the germination process.

Evaluación del efecto de cuatro polimorfismos en el gen del receptor adrenérgico beta - 2 en el parto pretérmino / Role of four polymorphisms of the beta - 2 adrenergic receptor gen in patients with preterm delivery

Objetivo: Determinar si los polimorfismos de nucleótido único encontrados en la secuencia del receptor β-2 adrenérgico β2AR) se asocian con el parto pretérmino espontáneo. Método: Se realizó un estudio de casos y controles no pareado en el que se determinaron y compararon las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas de cuatro polimorfismos, -47 C/T, -20 C/T, Arg16Gly y Gln27Glu del gen del β2AR, entre 35 mujeres con parto pretérmino (casos) y 105 mujeres con parto a término (controles). El estudio se hizo con pacientes de tres instituciones hospitalarias de la ciudad de Medellín, Colombia. Se aisló el ADN genómico de sangre periférica, se amplificó el segmento del gen mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se determinaron los polimorfismos por secuenciación directa. Resultados: No se encontraron diferencias significativas de las frecuencias alélicas de los loci polimórficos -47 C/T, -20 C/T, Arg16Gly y Gln27Glu entre el grupo de casos (21.5%, 21.5%, 51.5% y 21.5%, respectivamente) y los controles (21.5%, 21.5%, 57% y 21.5%, respectivamente (p>0.05). Las frecuencias genotípicas también fueron similares entre las pacientes con parto pretérmino y las de parto a término (p>0.05 para todos los genotipos). De los 16 posibles haplotipos, resultantes de la combinación entre los distintos alelos, sólo se presentaron tres en toda la población de estudio (CCGG, TTGC, TTAC). Las frecuencias haplotípicas tampoco tuvieron diferencias significativas entre los grupos comparados (p>0.05). Conclusión: No se observó una asociación entre el parto pretérmino y cualquiera de los polimorfismos o sus haplotipos. Estos resultados no apoyan una participación de los polimorfismos del β2AR en el trabajo de parto pretérmino espontßneo en estas pacientes.

Objective: To determine whether single nucleotide polymorphisms found in the sequence of the β-2 (β2AR) adrenergic receptor are associated with spontaneous preterm delivery. Method: A case-control study in which the allelic, genotype, and haplotype frequencies of four polymorphisms, -47 C/T, -20 C/T, Arg16Gly, and Gln27Glu of the β2AR gene, were determined and compared between 35 women with preterm delivery (cases) and 105 women with term delivery (controls). The study was performed with patients of three hospitals in the city of Medellín, Colombia. The genomic DNA of peripheral blood was isolated, the segment of the gene was amplified by means of the chain reaction of polymerase (PCR), and the polymorphisms were determined by direct sequence method. Results: No significant differences for the allelic frequencies were found for polymorphic loci -47 C/T, -20 C/T, Arg16Gly, and Gln27Glu between the cases group (21.5%, 21.5%, 51.5% and 21.5%, respectively) and controls (21.5%, 21.5%, 57% and 21.5%, respectively; p>0.05). The genotype frequencies were also similar between patients with preterm delivery and those with term delivery (p>0.05 for all the genotypes). Only three of the 16 possible haplotypes (CCGG, TTGC, and TTAC), from the combination between the different alleles, appeared in the participants of this study. The haplotype frequencies were not significantly different between the compared groups either (p>0.05). Conclusion: No association was observed between preterm delivery and any of the polymorphisms or its haplotypes. These results do not support a role of the polymorphisms of the β2AR in spontaneous preterm delivery for these patients.

Bases genéticas de la hipertensión arterial esencial en Colombia: avances en nueve años de estudio / Genetic basis of essential arterial hypertension in Colombia: advances in nine years of work

Las enfermedades cardiovasculares se han consolidado como las principales causas de enfermedad y muerte no violenta en Colombia. La hipertensión arterial es el desorden cardiovascular más frecuente en nuestra nación, con una prevalencia que oscila entre 13 porciento y 23 porciento (1, 2). Por la alta frecuencia en la población adulta, la hipertensión arterial es un factor de riesgo mayor para el desarrollo de enfermedad coronaria así como de enfermedad cerebrovascular y renal.Por más de cincuenta años se han investigado las causas de la hipertensión arterial y se ha descubierto que existen factores ambientales y genéticos que afectan la respuesta de órganos como el riñón o el cerebro y del sistema cardiovascular, que además provocan alteraciones en el control de la presión arterial y la hipertensión crónica. Algunos factores ambientales como exceso de calorías y sal en la dieta, sobrepeso, estrés sicosocial y consumo significativo de alcohol elevan la presión arterial (3), lo cual se ha corroborado en nuestra población (4). Sin embargo, poco se sabe acerca de qué factores genéticos participan en el desarrollo de la hipertensión. En la actualidad, se considera que el componente genético, aun no clarificado, determina un 30 porciento a 50 porciento de los niveles de presión arterial en las poblaciones (5).Para iniciar el estudio genético se tomó una población colombiana de tamaño mediano. De un total de 5.720 personas entre 18 y 65 años, se evaluaron 3.000, de donde se excluyeron individuos con primer grado de consanguinidad (1.998 sujetos). Se obtuvo la curva de distribución de la presión arterial con 1.002 individuos sin parentesco en quienes se estudiaron varios genes candidatos para hipertensión (6-22).Se ha encontrado que genes candidatos como el gen del angiotensinógeno (AGT) regulan la función renal y provocan retención de sal y vasoconstricción sistémica (23, 24). Otros genes están implicados en el trasporte molecular de sodio en el riñón, como el WNK1...

Presencia de Chlamydia pneumoniae en placas ateroscleróticas / Chlamydia pneumoniae presence in atherosclerotic plaques

Chlamydia pneumoniae es un patógeno mundialmente reconocido como causante de infecciones del tracto respiratorio en humanos, se caracteriza por ser un microorganismo intracelular obligado. Al presente, se ha comprobado su presencia en placas ateromatosas por múltiples técnicas como la inmunohistoquímica, la microscopía electrónica y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La enfermedad aterosclerótica, es responsable de muchos de los accidentes cerebrovasculares y cardiovasculares. Sin embargo el papel patogénico de este microorganismo en dicha enfermedad aun no es claro. En este estudio, por medio de ka reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se logró comprobar la presencia de C. pneumoniae en el 28 por ciento de 93 muestras de tejido vascular provenientes de pacientes que fueron sometidos a cirugía de revascularización quirúrgica. La presencia de este microorganismo en tejido vascular de pacientes con enfermedad coronaria podría considerarse como un factor de riesgo cardiovascular para el desarrollo de aterosclerosis y enfermedades cerebrovasculares

Evaluación de varias técnicas de extracción de ADN de Cryptococcus spp. a partir de muestras ambientales / Cryptococcus spp. DNA extraction from environmental samples

El género Cryptococcus comprende, al menos, 38 especies, pero sólo 3 se han informado como patógenas para el hombre y los animales: Cryptococcus laurentii, Cryptococcus albidus y Cryptococcus neoformans; esta última es la más frecuente. La infección se adquiere por la inhalación de los propágulos infectantes del medio ambiente. Los estudios del hábitat se han realizado con técnicas de extracción con soluciones tampón y cultivos en medios selectivos. El objetivo del trabajo fue evaluar varias técnicas de extracción del ADN de Cryptococcus spp . a partir de muestras ambientales. Como controles se emplearon aislamientos de C. neoformans, C. albidus, C. laurentii y Paracoccidiodes brasiliensis. Se emplearon vermiculitas, suelos contaminados en el laboratorio con 10 a 10 6 blastoconidias/g y muestras naturalmente colonizadas con C. neoformans. El ADN se extrajo con métodos físicos, químicos y con un estuche comercial, y se purificó usando bloques de agarosa y columnas de sílica. Para la amplificación con PCR se emplearon los iniciadores CN4-CN5 específicos para C. neoformans. Sólo el estuche comercial permitió extraer y purificar el ADN de las muestras de suelos contaminados hasta una concentración de 10 blastoconidias/g de suelo y de una de las muestras naturalmente colonizadas. Con este trabajo se logró la extracción y amplificación de ADN de Cryptococcus spp. a partir de muestras ambientales lo cual constituye una herramienta importante para delimitar las áreas ecológicas de C. neoformans en nuestro país

Molecular cloning and characterization of two hsp 70 homologous genes from the dimorphic fungus paracoccidioides brasiliensis / Clonaje y caracterización molecular de dos genes homólogos hsp70 del hongo dimórfico Paracoccidioides brasilensis

.Paracoccidiodes brasiliensis es el agente etiológico de la Paracoccidioidomicosis (PCM), una de las micosis sistémicas mas importantes en Latinoamérica. Dos genes hsp70 (Clones 2.2 y 1DB5) fueron clonados, caracterizados y secuenciados. El análisis de secuencia mostró que los clones 2.2 y 1DB5 poseen una alta homología con la familia de genes de choque térmico hsp70. Mediante la utilización de fragmentos de ADN provenientes de ambos clones, se determinó la expresión por Northern blot durante la fase de transición a levadura. Nosotros encontramos los niveles mas altos de transcriptos ocurre entre los 30 min y 6 h después de cambiar la temperatura a 37ºC. Entre las 36 y 48 h, se reducen los niveles de ARNm. Sin embargo, los niveles de ARNm aumentan a las 72 h hasta alcanzar la fase de levadura. Como resultado del aumento de la temperatura durante la fase de transición micelio a levadura, se incrementa la expresión de genes hsp70 sugiriendo que las proteínas de choque térmico tienen un papel durante el proceso de diferenciación.

Nuevos aspectos sobre la clasificación de los hongos y su posible aplicación médica / New fungal classification and their applications in medicine

En la última década se ha despertado un gran interés por el estudio de la clasificación de los hongos debido, principalmente, al número creciente de patógenos oportunistas. Actualmente, los métodos tradicionales para la identificación y clasificación de estos microorganismos se basan en criterios morfológicos y en las características de las estructuras de reproducción sexuada y asexuada. En los últimos años, sin embargo, se han demostrado incongruencias de este sistema de clasificación cuando se lo compara con nuevos acercamientos que permiten establecer relaciones de descendencia entre los organismos estudiados. Este artículo revisa varios aspectos novedosos: 1) la ubicación de los hongos en los diversos sistemas de clasificación propuestos en el transcurso de la historia; 2) el reconocimiento de la polifilia de los hongos, gracias al empleo de herramientas comparativas basadas en las secuencias de ácidos nucleicos y en el análisis de las relaciones de descendencia, y 3) los aportes de la filogenética molecular a varios aspectos de interés para la micología médica como son la identificación de los agentes micóticos, su epidemiología y prevención y el diagnóstico de las enfermedades que producen.